多细胞生物中的细胞不是彼此孤立的，而是组成相互依赖、相互制约的“细胞社会”。结构上，细胞通过紧密连接、黏着连接、桥粒和缝隙连接组成组织，并借助整联蛋白与胞外基质相连；物质上，细胞经组织液、血液和跨膜运输交换营养物、气体和代谢产物；信息上，内分泌、旁分泌、自分泌、突触及接触依赖信号协调细胞行为。不同细胞通过差异性基因表达形成分工，同时受增殖、分化、凋亡、免疫监视和组织位置的共同约束，从而维持机体稳态。

人体约由 10¹⁴ 个细胞构成，细胞社会性体现为三类联系。第一，结构联系：细胞连接将同类或异类细胞组装成组织，整联蛋白把胞外基质与细胞骨架连接成力学连续体。第二，物质联系：循环和组织液提供营养、氧及激素并带走代谢物，细胞之间还可通过缝隙连接交换离子和小分子。第三，信息联系：内分泌、旁分泌、自分泌、突触和接触信号控制增殖、分化、迁移和死亡。细胞在共同基因组基础上发生功能分工，并接受接触抑制、免疫监视及局部微环境的约束，因此个体生命活动是细胞协作与动态稳态的整体结果。

细胞社会是由细胞连接、胞外基质、物质交换和信号网络建立的有组织系统。正常细胞的生长依赖外源生长因子和合适的基质黏附，受到接触抑制、周期检查点、凋亡及免疫监视限制，并按组织需要分化和执行功能。癌变后，细胞可获得持续增殖信号、逃避生长抑制和凋亡、丧失接触抑制与锚定依赖，并通过 EMT、基质降解、血管生成和免疫逃逸侵袭其他组织。因而癌变的本质不仅是细胞分裂加快，更是单个细胞摆脱社会约束并改造微环境，使自身利益凌驾于组织整体利益之上。

细胞是生命活动的基本结构和功能单位。生物体的形态结构由细胞及其产物构成；物质代谢、能量转换和稳态维持依赖细胞内有序的膜系统和酶系统；遗传信息在细胞中储存、复制、转录和表达；新细胞由原有细胞分裂产生；个体发育则由细胞增殖、分化、迁移、凋亡和相互作用完成。病毒没有独立的代谢与蛋白质合成体系，必须寄生于宿主细胞，也从反面说明只有细胞才能构成相对完整的生命活动系统。

原核细胞与真核细胞都以 DNA 储存遗传信息、以核糖体合成蛋白质并以 ATP 作为主要能量货币。二者生命活动的本质差异是区室化程度不同：原核细胞没有核膜和典型膜性细胞器，转录和翻译可在胞质中耦联，调控链条较直接；真核细胞由核膜将转录、RNA 加工和翻译分开，内膜系统负责蛋白质修饰与分选，线粒体或叶绿体集中完成能量转换，细胞骨架和马达蛋白承担长距离运输。区室化提高了反应效率和调控精度，也支持更大的细胞体积与复杂功能。

维持细胞生存至少需要六类功能系统：①质膜形成选择性边界，完成物质运输、膜电位和信号接收；②DNA/RNA 系统储存、复制并表达遗传信息；③核糖体及翻译因子合成蛋白质；④代谢酶和能量转换膜系产生 ATP 与代谢中间物；⑤蛋白质折叠、修复、降解和废物清除系统维持质量控制；⑥细胞骨架和调控网络维持形态、内部运输及稳态。不同细胞实现这些功能的结构可不同，因此应按功能模块回答，不能断言某一种膜性细胞器对所有细胞都绝对必需。

质膜以两亲性脂质双层为基本骨架，主要含磷脂、糖脂和胆固醇。膜蛋白包括跨膜蛋白、脂锚定蛋白和外周膜蛋白，糖链只分布于非胞质侧并形成糖萼。流动镶嵌模型强调脂质和多数膜蛋白可在膜平面内运动，但运动会受细胞骨架、细胞连接和脂筏微区限制。质膜还具有明显不对称性：内外层脂质组成、膜蛋白方向和糖链分布不同。这种动态、非均一和不对称的结构使质膜能够执行屏障、运输、信号、黏附、识别和能量转换等功能。

质膜的化学成分为脂质、蛋白质和糖类。脂质双层构成疏水屏障，胆固醇缓冲膜流动性；跨膜、脂锚定和外周蛋白分别承担运输、受体、酶、黏附及骨架连接；糖脂和糖蛋白的寡糖链位于细胞外侧，参与保护和识别。其结构特性包括流动性、不对称性、选择通透性和动态微区。由此产生的功能包括维持内环境和膜电位、选择性跨膜运输、胞吞胞吐、信号接收与放大、细胞识别和连接、锚定细胞骨架及某些膜上的能量转换。

膜的流动性表现为脂质和多数蛋白可横向扩散，证据有人—鼠细胞融合后膜抗原逐渐混合以及 FRAP 漂白区荧光恢复。流动性受温度、脂肪酸链长与不饱和度、胆固醇和骨架锚定调节，是膜泡出芽融合、受体聚集、细胞运动和膜自我修复的基础。不对称性表现为外层富含磷脂酰胆碱、鞘磷脂和糖脂，内层富含磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺和 PIP₂；糖链朝非胞质侧，膜蛋白具有固定拓扑。不对称性维持膜电位、信号和细胞识别，凋亡时磷脂酰丝氨酸外翻还构成吞噬信号。

流动镶嵌模型中的流动性包括脂质和膜蛋白的侧向扩散、膜的弯曲及融合；脂质跨层翻转很少自发发生，通常由 flippase、floppase 或 scramblase 调节。膜筏、细胞骨架围栏和细胞连接会限制自由扩散，使膜形成动态微区。不对称性包括内外层脂质组成不同、糖链只位于非胞质面、膜蛋白的胞外和胞质结构域方向固定。流动性保证运输、信号和形态改变，不对称性保证受体方向、膜电位、细胞识别和不同膜面的专门功能，二者共同实现膜结构与功能的统一。

一般规律是低温使膜脂排列紧密、流动性下降，细胞常通过增加不饱和脂肪酸、缩短脂肪酸链并调整胆固醇含量维持适宜流动性；因此“冬眠时饱和程度必然升高”并不是普遍结论。若特定动物或组织确实出现饱和度升高，应理解为膜脂组成、胆固醇、脂类种类和代谢抑制共同适应的结果，而不能只由单一指标推断流动性。答题时应先指出低温适应的一般机制，再说明物种、组织及测定膜系不同可能造成例外。

动物细胞质膜由脂质双层、膜蛋白和非胞质侧糖链构成，具有流动性、不对称性和选择通透性。细胞表面的范围更大，除质膜外还包括糖萼、与膜结合的细胞外基质以及细胞连接装置。糖萼参与保护、识别和黏附；钙黏蛋白、整联蛋白等跨膜受体分别连接相邻细胞或 ECM，并在胞质侧连接肌动蛋白或中间纤维。因而质膜是细胞表面的结构核心，而细胞表面是质膜、膜被、连接和基质共同组成的功能界面，承担屏障、运输、力学耦联和信息交换。

受体介导内吞是细胞选择性摄取特定大分子的过程。配体与膜受体结合后，受体胞质尾部的分选信号通过接头蛋白集中到网格蛋白包被窝；膜内陷后由 dynamin 缢裂形成囊泡，随即去包被并与早期内体融合。内体酸化常使配体与受体分离，受体可回收至质膜，也可与配体一起进入晚期内体和溶酶体降解。该过程具有特异、浓缩和可调控等特点，用于摄取胆固醇、铁和生长因子，并通过受体回收或降解决定细胞对信号的敏感性和持续时间。

LDL 颗粒上的 ApoB100 与质膜 LDLR 结合，受体通过胞质分选序列在 clathrin 包被窝聚集，dynamin 促囊泡缢裂。去包被囊泡与早期内体融合，内体酸化使 LDL 与受体分离；LDLR 多经回收内体返回质膜，LDL 则进入晚期内体和溶酶体，其胆固醇酯被水解释放游离胆固醇。升高的胞内胆固醇抑制 HMG-CoA 还原酶和 LDLR 合成，并促进胆固醇酯化储存。LDLR 缺陷会导致血 LDL 升高并引起家族性高胆固醇血症。

ApoE 是乳糜微粒残粒和 VLDL 残粒表面的受体配体，可被肝细胞 LDLR、LRP 等受体识别并通过受体介导内吞清除。ApoE 缺失时，富含胆固醇的残粒不能有效被肝脏摄取，因而在血液中积累并进入血管壁；巨噬细胞摄取修饰脂蛋白后形成泡沫细胞，促进脂纹、炎症和粥样斑块形成。ApoE^-/- 小鼠因此可稳定出现高胆固醇血症和动脉粥样硬化，常用于研究疾病机制及评价降脂、抗炎治疗。

小肠上皮顶端膜的 SGLT 利用 Na⁺顺电化学梯度进入细胞所释放的能量，将葡萄糖逆浓度梯度同向转运入细胞；基底侧 Na⁺/K⁺-ATPase 消耗 ATP，把 Na⁺泵出并维持低胞质 Na⁺，葡萄糖再由 GLUT 协助扩散进入组织液。乌本苷抑制 Na⁺/K⁺-ATPase 后，Na⁺梯度逐渐耗散，SGLT 失去驱动力，所以葡萄糖吸收被间接抑制。乌本苷并不直接抑制 SGLT。

从细胞运输角度，肠上皮和肾小管的 SGLT 依赖 Na⁺电化学梯度协同转运葡萄糖，而该梯度由 Na⁺/K⁺-ATPase 维持；因此 Na⁺稳态会影响葡萄糖吸收和重吸收。但临床低盐建议的主要目的通常是降低容量负荷、血压以及糖尿病肾病和心血管风险，并不能简单理解为“少吃 Na⁺即可直接阻断 SGLT、治疗高血糖”。完整答案应同时说明细胞运输机制和整体生理、临床层面的限制。

高盐摄入后，胞外 Na⁺和渗透压升高趋势会促进饮水与抗利尿激素调节。细胞通过 Na⁺/K⁺-ATPase、离子通道、交换体和渗透性调节维持胞内低 Na⁺及细胞体积；肾脏通过滤过、重吸收和排钠，并受肾素—血管紧张素—醛固酮系统、利钠肽和交感神经调节，在一定时间内恢复体液稳态。因此短期可无明显病态。若长期摄盐过多，代偿会造成容量负荷和血压升高，并增加血管、心脏和肾脏损伤风险。

静息细胞胞质游离 Ca²⁺约为 10^-7 mol/L，显著低于胞外液约 10^-3 mol/L，也低于内质网腔等细胞内钙库。质膜 Ca²⁺-ATPase 和 Na⁺/Ca²⁺交换体把 Ca²⁺排出，SERCA 将其泵回 ER，线粒体摄取和钙结合蛋白共同缓冲；通道关闭及泵持续工作维持梯度。刺激时质膜或 ER 通道短暂开放形成 Ca²⁺脉冲，Ca²⁺结合 calmodulin 等效应器调节收缩、分泌、代谢、转录和受精。低静息浓度带来高信噪比，而及时清除保证信号可逆并避免钙毒性。

各种生物膜均以脂质双层为共同框架，膜蛋白有确定拓扑，腔面在膜泡运输中保持与胞外面拓扑等价。但不同膜的脂质/蛋白比例、特异蛋白、膜曲率和面积与功能相适应。例如线粒体内膜富含呼吸链和 ATP 合酶并形成嵴以扩大面积；叶绿体类囊体膜容纳光系统；髓鞘脂质比例高，适合电绝缘；ER 膜形成片层和小管以进行合成，Golgi 扁囊适合顺序加工。因此共性保证膜的基本屏障和流动性质，差异则由特异成分与形态赋予专门功能。

胞外基质由胶原和弹性蛋白等纤维成分、GAG/蛋白聚糖形成的水合凝胶以及纤连蛋白、层粘连蛋白等多黏性糖蛋白组成。胶原抗张，弹性蛋白赋予回弹，蛋白聚糖吸水抗压并储存信号分子。质膜上的整联蛋白是主要连接受体：胞外结合纤连蛋白、层粘连蛋白或胶原相关配体，胞内在黏着斑中通过 talin、vinculin 等连接肌动蛋白，在半桥粒中连接角蛋白中间纤维。该跨膜连续体既传递机械力，又通过 FAK/Src、Rho 等完成双向信号转导。

细胞外基质是由细胞分泌并组织于细胞外的蛋白质和多糖网络，不是惰性填充物。其主要成分为：胶原三股螺旋纤维，提供抗张强度；弹性蛋白交联网络，提供弹性；带负电的 GAG 和蛋白聚糖形成水合凝胶，抗压、筛分并结合生长因子；纤连蛋白和层粘连蛋白具有多个结合结构域，组织其他基质成分。整联蛋白跨越质膜，将 ECM 与肌动蛋白或中间纤维相连，并传递黏附、存活、增殖和机械信号，体现 ECM 与质膜的结构和功能联系。

蛋白聚糖是一个核心蛋白共价连接一条或多条糖胺聚糖链形成的大分子复合物；GAG 由重复二糖组成，常带大量硫酸基和羧基，呈强负电并吸引水和阳离子。透明质酸不硫酸化且通常不与核心蛋白共价连接，是重要例外。蛋白聚糖可形成水合凝胶，赋予软骨等组织抗压性；控制分子扩散和组织通透性；作为共受体结合、储存并呈递生长因子；还参与基底膜过滤、细胞黏附、迁移和 ECM 组装。

胶原 α 链在粗面内质网上合成并进入 ER 腔，特定 Pro 和 Lys 被羟化，部分羟赖氨酸糖基化；三条链由 C 端前肽配对并形成前胶原三股螺旋。前胶原经 Golgi 修饰和分泌后，胞外前胶原肽酶切除两端前肽，形成原胶原分子；原胶原错位排列组装成原纤维，赖氨酰氧化酶催化 Lys/Hyl 氧化并产生共价交联，最终形成高强度胶原纤维。其 Gly-X-Y 重复和三股螺旋是结构稳定的基础。

胶原装配经历 RER 合成 α 链、Pro/Lys 羟化、糖基化、三螺旋前胶原形成、Golgi 分泌、胞外切除前肽、错位聚集和共价交联。影响因素包括：维生素 C、Fe²⁺、O₂和 α-酮戊二酸影响羟化；铜影响赖氨酰氧化酶；前胶原肽酶和胶原链突变影响成熟；温度、pH、离子环境和纤维连接蛋白等基质组织者影响成纤；MMP 则参与降解与重塑。维生素 C 缺乏会使三螺旋不稳并导致坏血病，铜代谢或胶原基因异常也可造成结缔组织疾病。

动物组织细胞连接可分为三类。封闭连接即紧密连接，以 claudin、occludin 等构成，既限制旁细胞通透又维持顶端—基底侧极性。锚定连接包括黏着连接、桥粒、黏着斑和半桥粒：cadherin 将相邻细胞的肌动蛋白或中间纤维相连，integrin 将细胞骨架与 ECM 相连，承担组织成形和抗机械力。通讯连接主要为缝隙连接，由连接子对接形成通道，允许离子和小分子第二信使通过。不同连接共同维持组织结构、屏障、力传递和细胞协同。

间隙连接又称缝隙连接。每个连接子由 6 个 connexin 亚基围成，相邻细胞各提供一个连接子并对接成跨细胞通道；通道允许离子和约 1 kDa 以下小分子通过，可受 Ca²⁺、pH 和磷酸化调节。实验上向一个细胞微注射不能自由穿膜的小分子荧光染料，若染料随时间进入相邻细胞而不进入不相邻细胞，说明存在直接通讯。应设置大分子染料、connexin 缺失或阻断剂对照；还可用双细胞膜片钳检测电耦联。阻断后染料/电流传递消失即可支持因果关系。

小肠上皮顶端紧密连接具有两项核心作用。其一是屏障作用：claudin、occludin 等封闭相邻细胞间隙，选择性控制水、离子和溶质的旁细胞通路，阻止腔内容物无控制进入组织。其二是栅栏作用：限制膜脂和膜蛋白在顶端膜与基底侧膜之间横向扩散，使 SGLT、消化酶等顶端蛋白与 Na⁺/K⁺-ATPase、GLUT 等基底侧蛋白保持分区，从而建立上皮极性和定向跨上皮运输。紧密连接还通过 ZO 蛋白连接肌动蛋白并参与信号调节。

细胞质骨架由微丝、微管和中间纤维组成，具有极性装配、动态重塑或高抗张性等特点；胞外基质由胶原、弹性蛋白、蛋白聚糖及黏附糖蛋白构成。二者通过跨膜受体形成连续体：黏着斑中整联蛋白胞外结合 ECM，胞内经 talin、vinculin 等连接肌动蛋白；半桥粒中 integrin α6β4 连接基底膜与角蛋白中间纤维。肌动蛋白张力可改变整联蛋白亲和力，ECM 硬度也可经 FAK/Src、Rho 和 YAP/TAZ 影响细胞增殖与分化，因此该连接同时承担力学支撑和双向机械信号。

内膜系统包括核膜、内质网、高尔基体、内体、溶酶体、运输/分泌囊泡和质膜。核外膜与粗面内质网直接连续，其余区室通过膜泡出芽和融合联系；内吞途径又将质膜和胞外物质送入内体、溶酶体。新生分泌蛋白在 RER 合成和折叠，经 COPII 运至 Golgi 加工，再由 TGN 分选至质膜、分泌泡或溶酶体；COPI 负责逆向回收，clathrin 参与内吞和 TGN—内体运输。运输中胞质面始终朝胞质，腔面经胞吐后相当于胞外面，体现结构、拓扑和功能的整体性。

高尔基体由顺面网络、顺/中/反面扁囊和反面网络组成，具有明确极性。顺面通常靠近 ER 和细胞核，接受来自 ER 的 COPII 货物；不同扁囊含有区域化加工酶，依次完成糖链修剪、糖基化和硫酸化；反面及 TGN 朝向质膜一侧，将货物分选至质膜、分泌颗粒或内体/溶酶体。扁囊成熟与逆向膜泡回收共同维持酶的区域化。Golgi 的围核定位依赖微管和 dynein，结构方向、酶分布和物质流向三方面共同说明其为极性细胞器。

Golgi 的顺面靠近 ER/细胞核并接收 ER 来源货物，反面通常朝向质膜；其亚显微结构依次为 CGN、顺面扁囊、中间扁囊、反面扁囊和 TGN。加工酶沿顺反方向区域化分布，使蛋白质和脂质依次经历糖链修剪、添加、硫酸化等反应；TGN 再按分选信号包装到不同运输泡。顺向货物随扁囊成熟推进，驻留酶经 COPI 逆向回收。位置方向、扁囊分区、酶分布和单向物流彼此一致，因此高尔基体具有鲜明极性。

假设 Golgi 围核定位依赖微管。培养细胞分为溶剂对照、微管去聚合剂组（如 nocodazole 或秋水仙素）和洗脱恢复组；处理后固定，用抗 α-tubulin 显示微管、GM130 或 giantin 显示 Golgi，并进行共聚焦定量。预期对照组微管完整且 Golgi 集中于核周；药物组微管消失、Golgi 碎片分散到胞质；洗脱后微管重建且 Golgi 重新聚集。可加入微丝抑制剂作为骨架特异性对照。若 Golgi 分散与微管破坏同步且可逆恢复，即支持微管决定其有序定位。

秋水仙素结合游离微管蛋白并抑制微管聚合，使细胞内微管网络解体。ER 小管的伸展和分布依赖微管及 kinesin/dynein 运输，Golgi 碎片向微管负端的核周聚集主要依赖 dynein；微管还是 ER—Golgi 囊泡长距离运输的轨道。微管破坏后，ER 网络变得紊乱，Golgi 由核周带状结构分散成胞质小体，膜泡定向运输效率下降。因此药物不是直接溶解 ER 或 Golgi 膜，而是破坏维持其空间组织的骨架—马达系统。

膜泡运输包括 ER—Golgi 顺向运输、Golgi—ER 及 Golgi 内逆向回收、TGN 输出、内吞和内体—溶酶体运输。共同过程为：货物信号被受体识别，小 GTPase 和接头蛋白募集包被使膜弯曲出芽；COPII 主要介导 ER 向 Golgi，COPI 介导 Golgi 向 ER/内部逆向，clathrin 介导质膜内吞及 TGN 向内体。囊泡去包被后沿骨架运输，Rab-GTP 与系链因子完成初步识别，v-SNARE 和 t-SNARE 特异配对促膜融合。包被负责选择和出芽，Rab/系链/SNARE 共同保证方向和特异性。

N-连接糖基化在 ER 腔面开始：预先组装在 dolichol 上的寡糖整体转移到 Asn-X-Ser/Thr，随后进行葡萄糖/甘露糖修剪，并借 calnexin/calreticulin 参与折叠质控；进入 Golgi 后继续修剪和添加，形成高甘露糖、杂合或复合型糖链。O-连接糖基化多在 Golgi 中逐个把单糖加到 Ser/Thr。两者都发生在内膜系统腔面，成熟后朝细胞外；区别在受体氨基酸、起始细胞器和糖链转移方式。二者共同影响折叠、稳定、分选、细胞识别和糖萼形成。

蛋白质糖基化可促进折叠、提高稳定性、决定分选并参与识别。例一：ER 中 N-糖链经葡萄糖修剪进入 calnexin/calreticulin 循环，只有正确折叠的蛋白才能离开 ER，持续错误折叠者被送入 ERAD。例二：溶酶体水解酶的 N-糖链在 Golgi 被加上甘露糖-6-磷酸，TGN 中 M6P 受体识别该标志并将酶送往内体/溶酶体。还可举糖萼参与细胞识别、黏液蛋白 O-糖基化增强抗蛋白酶性等。

可溶性 ER 驻留蛋白的 C 端带 KDEL 信号。少量蛋白随顺向运输逃逸到 Golgi 后，Golgi 较酸环境提高 KDEL 受体对 KDEL 的亲和力；受体胞质尾部募集 COPI 包被，把复合物逆向运回 ER。ER 较中性的环境促使驻留蛋白释放，KDEL 受体再返回 Golgi 循环。由此，定位并非绝对阻止蛋白离开 ER，而是通过“逃逸—捕获—回收”保持稳态。ER 膜蛋白还可利用 KKXX/KXKXX 等胞质侧信号直接与 COPI 机制联系。

完整 BiP 的 N 端含 ER 信号肽，使翻译中的多肽被 SRP 引导到 ER 并共翻译转位；其 C 端 KDEL 则使逃逸到 Golgi 的蛋白由 KDEL 受体和 COPI 回收到 ER。单独表达 N 端片段时，它仍可进入 ER，但因缺少 C 端 KDEL，不能有效回收，故可同时见于 ER 和 Golgi。单独表达 C 端片段虽可能含 KDEL，却没有 N 端信号肽，翻译在游离核糖体上完成且不能跨入 ER 腔，因此留在胞质。说明分选信号只有位于正确拓扑位置并按顺序发挥作用才有效。

溶酶体执行异噬、自噬、胞外消化、膜修复和代谢物回收。酸性水解酶在 RER 合成并 N-糖基化，经 Golgi 后由磷酸转移酶识别酶的信号斑并在甘露糖上形成 M6P。TGN 中 M6P 受体在 clathrin/AP 包被泡内富集酶，运至酸性内体；低 pH 使酶与受体分离，受体回收，水解酶随内体成熟进入溶酶体并被加工成熟。V 型 H⁺-ATPase 维持酸性环境，膜蛋白高度糖基化以抵抗自身水解。分选或酶缺陷可造成溶酶体贮积病。

按形成和消化阶段，初级溶酶体是尚未与底物区室融合、含水解酶的囊泡；次级溶酶体是其与内吞体、吞噬体或自噬体融合后正在消化的异噬溶酶体或自噬溶酶体；不能完全消化的物质形成残余体，可经胞吐排出或在细胞内积累。功能上，溶酶体分解胞外摄入物和病原体，清除损伤细胞器及长寿命蛋白，回收氨基酸和脂肪酸，参与质膜修复、骨吸收及某些调节性分泌，并通过 mTOR 等感知营养状态。

溶酶体水解酶在 RER 合成，进入 ER 腔折叠并 N-糖基化，随后到 Golgi 获得 M6P 分选标志。TGN 中 M6P 受体集中水解酶并形成 clathrin 包被泡，囊泡与早期/晚期内体融合；内体酸化使酶与受体分离，受体返回 TGN，水解酶经蛋白水解成熟。内吞途径不断提供膜和待降解底物，晚期内体与溶酶体之间发生融合、分裂和成熟，形成具有酸性环境及多种活性水解酶的功能性溶酶体。

过氧化物酶体可通过两条互补途径形成：已有过氧化物酶体吸收新合成的膜蛋白和基质蛋白后生长，再由 Pex11、DRP 等介导分裂；也可由 ER 及线粒体来源的前体囊泡融合后从头组装。大多数基质蛋白在游离核糖体上完成合成，C 端 PTS1 或 N 端 PTS2 被 Pex5/Pex7 受体识别，停靠于膜上转位装置并进入基质，受体再循环。过氧化物酶体能够输入折叠甚至寡聚蛋白，且不依赖内膜系统的膜泡货运将基质蛋白送入。

滑面内质网主要以细胞色素 P450 单加氧酶系统进行解毒：利用 NADPH 和 O₂把疏水性药物或毒物羟化，使其更易进一步结合并排出；长期药物刺激可诱导 SER 增生。过氧化物酶体则由多种氧化酶把底物氢转移给 O₂生成 H₂O₂，再由 catalase 将 H₂O₂分解为水和氧，或利用其氧化其他底物。前者重点是疏水外源物的羟化，后者重点是氧化代谢与过氧化氢的产生、清除，两者机制和底物体系不同。

核糖体是无膜的核糖核蛋白颗粒，由大小两个亚基组成；真核胞质核糖体为 80S，包括 40S 和 60S 亚基，主要成分是 rRNA 和核糖体蛋白。小亚基含解码中心，负责 mRNA 与 tRNA 密码子—反密码子配对；大亚基含由 rRNA 构成的肽酰转移酶中心，催化肽键形成。核糖体具有 A、P、E 三个 tRNA 位点，氨酰 tRNA 进入 A 位，肽酰链位于 P 位，去酰 tRNA 从 E 位离开。游离与 ER 结合核糖体结构相同，去向由新生链信号决定。

蛋白质合成场所是核糖体。小亚基的主要功能位点为 mRNA 结合和解码中心；大亚基含肽酰转移酶中心及新生肽出口通道。跨两个亚基形成 A、P、E 三个位点：A 位接受新的氨酰 tRNA，P 位持有肽酰 tRNA并完成肽链转移，E 位结合即将离开的去酰 tRNA。起始因子、延伸因子和终止因子依次参与起始、氨酰 tRNA 选择与易位、释放。rRNA 直接催化肽键形成，因此核糖体本质上也是核酶。

分子伴侣是一类帮助其他蛋白正确折叠、装配或跨膜转运，而不作为最终结构成分、也不决定一级结构的蛋白。Hsp70 具有底物结合域和 ATPase 域，与 Hsp40 协同反复结合新生或暴露疏水片段，防止聚集并促进折叠；Hsp60/chaperonin 由双环形成隔离腔，底物进入腔内后由 ATP 驱动盖帽开闭，在受限空间中重新折叠。分子伴侣还参与应激保护、错误折叠蛋白递送降解及蛋白跨线粒体/ER 膜时保持未折叠状态。

膜蛋白拓扑由信号肽、起始转移序列、停止转移序列及跨膜段两侧电荷决定，并在 ER 共翻译转位时建立。例如单次跨膜受体必须使配体结合域朝 ER 腔面、最终朝胞外，而激酶结构域朝胞质；若方向颠倒，受体即使插入膜也不能把胞外信号传给胞质。Na⁺/K⁺-ATPase 等多跨膜泵也要求各跨膜螺旋和胞质 ATP 结合域方向正确，才能耦联 ATP 水解与离子运输。因此蛋白质“位于哪张膜”与“在膜中的方向”共同决定功能。

亲核蛋白在胞质合成后，其核定位信号 NLS 被 importin-α/β 或相应 importin 识别，形成复合物并与核孔 FG-repeat 核孔蛋白反复结合，通过中央通道进入细胞核。核内 Ran-GTP 与 importin 结合，使货物释放；importin-Ran-GTP 返回胞质后，RanGAP 促进 GTP 水解并使受体解离。Ran-GDP 由 NTF2 运回核内，核内 RCC1 将其转换为 Ran-GTP。核内高 Ran-GTP、胞质高 Ran-GDP 的梯度提供运输方向性；NLS 通常不被切除，蛋白可反复入核。

所有核基因编码蛋白都在胞质游离核糖体上起始翻译，其分选由信号序列决定。无分选信号的蛋白默认留在胞质；带 NLS 的折叠蛋白经核孔门控运输入核；带线粒体、叶绿体或过氧化物酶体靶向信号者由各自受体识别并跨膜输入。带 ER 信号肽的新生链被 SRP 引导至 ER，进入分泌途径，再经 Golgi 分选到质膜、胞外或溶酶体。三种基本方式是核孔门控运输、蛋白跨膜运输和膜泡运输；前两者可改变区室，膜泡运输则保持膜拓扑。

核基因编码蛋白均在胞质游离核糖体上开始合成。没有分选信号者留在胞质；含 NLS 者经 importin—Ran 系统入核；含线粒体或叶绿体前导肽者分别经 TOM/TIM 或 TOC/TIC 跨膜输入；含 PTS 者由 Pex 受体输入过氧化物酶体。含 ER 信号肽的新生链由 SRP 暂停翻译并导向 ER 转位子，完成折叠、二硫键和 N-糖基化，经 COPII 到 Golgi 加工，再由 TGN 分送到质膜、分泌颗粒或内体/溶酶体；ER/Golgi 驻留蛋白依靠 KDEL、KKXX 等回收。信号的识别、跨膜或膜泡运输及质量控制共同决定最终命运。

非肌肉细胞微丝结合蛋白可按功能分类：①Arp2/3、formin 等成核和延伸因子产生分支网或直线丝；②profilin、thymosin 调节单体供应；③CapZ、tropomodulin 等封端蛋白控制长度；④cofilin、gelsolin 切割或促进去聚合；⑤fimbrin、α-actinin、filamin 把微丝交联成束或网；⑥ERM、spectrin 等连接质膜；⑦myosin 马达产生收缩和运输。它们使同一肌动蛋白系统形成片状伪足、微绒毛、应力纤维和收缩环，并快速响应信号。

肌动蛋白单体结合 ATP 并具有方向性，装配经历成核、延伸和稳态三个阶段。正端临界浓度低、增长快，负端增长慢；单体加入后 ATP 水解，ADP-actin 更易从负端解离，在适当浓度下出现正端加入、负端解离的踏车行为。细胞内由 Arp2/3 形成分支网络，formin 形成直线丝，profilin、cofilin、封端和交联蛋白调节动力学。Rho 家族信号将装配定位到前缘、应力纤维或收缩环，因此微丝既有极性和动态性，又具有高度时空调控。

微管是由 α/β-微管蛋白异二聚体首尾排列形成原纤维，通常 13 条原纤维组成中空管壁；具有负端和增长较快的正端，负端常锚定在中心体等 MTOC 的 γ-TuRC 上。微管提供长距离运输轨道，kinesin 多数向正端运输囊泡、细胞器和蛋白复合体，cytoplasmic dynein 向负端运输并维持 Golgi 围核定位；轴丝 dynein 驱动纤毛和鞭毛弯曲。微管还构成纺锤体，参与染色体捕获和分离。因此其极性决定运输方向，动态装配使轨道可随细胞状态重建。

微管为直径约 25 nm 的中空管，由 13 条 α/β-微管蛋白原纤维平行组成，具有正负端。GTP-微管蛋白优先加到正端，聚合后 β-微管蛋白上的 GTP 水解；保留 GTP 帽时微管稳定增长，帽丢失后快速去聚合称灾变，重新获得帽而转为增长称拯救，即动态不稳定性。中心体 γ-TuRC 负责成核并锚定负端。MAP、端结合蛋白和马达调控其稳定性；秋水仙素/长春花碱抑制聚合，紫杉醇过度稳定微管，二者都破坏正常动态功能。

中间纤维直径约 10 nm，由纤维状蛋白形成无明显极性的绳索样结构，较微丝和微管稳定，主要承担抗张力。角蛋白连接上皮桥粒和半桥粒，维持组织在牵拉下的完整性；结蛋白组织肌细胞肌节；神经丝维持轴突直径；vimentin 支撑间充质细胞；lamin 构成核纤层，支持核膜并组织染色质。不同组织表达特异中间纤维，故可作为细胞来源和肿瘤诊断标志。其功能重点是力学稳定和结构整合，而不是作为马达运输轨道。

有丝分裂中微管形成纺锤体：动粒微管连接染色体，极间微管相互交叠，星体微管连接细胞皮层；肌动蛋白—肌球蛋白形成分裂沟收缩环。纺锤体需要微管持续聚合和去聚合才能捕获动粒、校正错误连接、排列并分离染色体。长春花碱结合微管蛋白并抑制聚合，紫杉醇则使微管过度稳定、抑制解聚，作用方向相反但都消除必要的动态性，使动粒不能获得正常双极附着和张力，纺锤体组装检查点持续活化，细胞停滞于中期样状态。

马达蛋白通过在极性微管上产生定向力组织纺锤体。部分 kinesin 使两中心体分离并推动反向平行的极间微管滑动；Kinesin-5 产生向外推力，Kinesin-14 等产生相反力以平衡纺锤长度。dynein 在细胞皮层牵拉星体微管并定位纺锤体，也运输聚焦纺锤极所需蛋白；动粒马达和微管端耦联蛋白协助染色体运动。马达之间及与微管聚合/解聚力的平衡决定双极纺锤体建立、极点聚焦、染色体排列和分裂轴方向。

后期包括后期 A 和后期 B。后期开始时 APC/C 促 securin 降解，释放 separase 切开 cohesin，姐妹染色单体分离。后期 A 中，动粒微管在动粒端或纺锤极端去聚合，染色体通过与微管端耦联和马达作用向两极移动。后期 B 中，反向平行的极间微管继续聚合并由 kinesin 相对滑动，使两极分开；皮层 dynein 牵拉星体微管也扩大极间距离。两种机制协调保证染色体远离中央并为胞质分裂腾出空间。

细胞骨架由微丝、微管和中间纤维构成，负责维持形态和机械强度、建立极性、定位细胞器、进行囊泡和细胞器运输、驱动细胞迁移与肌肉收缩、完成纤毛运动、染色体分离和胞质分裂，并参与黏附及信号转导。其动态性可由两个实例说明：微管依靠 GTP 帽在增长与灾变间切换，分裂期迅速重组为纺锤体；微丝在正端聚合、负端解聚形成踏车，迁移细胞前缘持续伸展而后缘收缩。动态不稳定不是结构缺陷，而是快速重构和空间搜索的基础。

嗜中性粒细胞首先由 GPCR 等趋化受体感知细菌产物、补体 C5a 或趋化因子梯度，PI3K、Rac/Cdc42 等在前缘激活 Arp2/3，促肌动蛋白分支聚合形成伪足；后缘 RhoA—myosin II 收缩。选择素介导滚动，整联蛋白活化后实现牢固黏附和穿越内皮，细胞沿梯度迁移。接触细菌后受体触发肌动蛋白包围形成吞噬体，吞噬体与颗粒及溶酶体融合；酸性水解酶、ROS、髓过氧化物酶和抗菌肽杀灭细菌。随后凋亡并被巨噬细胞清除，有助终止炎症。

核被膜由内、外两层单位膜组成，中间为核周隙。外核膜与粗面内质网连续，胞质面可附着核糖体；内核膜含特异膜蛋白，内侧连接由 lamins 构成的核纤层并锚定染色质。内外膜在核孔处融合并嵌入核孔复合体，后者具有八重对称、胞质丝、中央通道和核篮，控制被动扩散及受体介导的选择性核质运输。分裂期核被膜可在 CDK1 磷酸化作用下解体，并在末期去磷酸化后重新装配。

核纤层位于内核膜下，由 A/C 型和 B 型 lamin 中间纤维及膜蛋白组成，支持核形态、锚定核孔、组织异染色质，并参与复制、转录和 DNA 修复。核孔复合体由多种 nucleoporin 以八重对称排列，含胞质丝、中央 FG-repeat 选择屏障和核篮；小分子可扩散，大分子依靠 importin/exportin 与 Ran 梯度定向运输。二者结构相连且在有丝分裂中协调重构：核纤层磷酸化解聚有助核膜和核孔拆除，去磷酸化则促进末期重建。

核纤层是紧贴内核膜的 lamin 中间纤维网，维持核形态并连接内膜蛋白、核孔和染色质。进入 M 期时，Cyclin B-CDK1 磷酸化 lamins，使聚合体解聚；同时核孔和内核膜蛋白被磷酸化，核被膜破裂并并入 ER。末期 APC/C 促 Cyclin B 降解，CDK1 活性下降，磷酸酶使 lamins 去磷酸化并重新聚合，新核膜在染色体表面形成。因此核纤层的可逆磷酸化是开放式有丝分裂中核膜周期性解体和重建的关键开关。

核小体是染色质的基本结构单位。两个 H2A-H2B 二聚体和一个 (H3-H4)₂四聚体组成组蛋白八聚体，约 147 bp DNA 在其外缠绕约 1.65 圈；相邻核小体间由连接 DNA 相连，H1 结合 DNA 进出点并促进进一步压缩。组蛋白 N 端尾部伸出核小体，可发生乙酰化、甲基化等修饰并调节染色质可及性。核小体既压缩 DNA，又通过滑动、拆装和修饰动态控制复制、修复和转录。

复制后，新旧 H3-H4 先形成四聚体并沉积到 DNA，随后加入两个 H2A-H2B 二聚体，约 147 bp DNA 缠绕形成核小体；CAF-1、NAP1 等伴侣和染色质重塑复合物参与装配与定位，H1 再结合连接 DNA。经典教材模型认为核小体链在 H1 和离子作用下形成约 30 nm 螺线管或之字形纤维，并进一步形成环状结构域。现代原位研究显示活细胞间期染色质常是不规则、异质的核小体折叠，规则 30 nm 纤维并非普遍存在。考研可写经典层级，同时注明其为模型。

约 2 m 的 DNA 通过多级、动态包装容纳于数微米细胞核。一级结构是 DNA 缠绕组蛋白八聚体形成核小体，使长度显著缩短；核小体链在 H1、离子和相邻核小体作用下进一步折叠，经典模型称 30 nm 纤维。染色质再形成环状结构域并锚定于核骨架/核纤层，拓扑相关结构域和区室化组织使不同区域有序排列。进入分裂期后，凝缩蛋白、拓扑异构酶 II 和轴蛋白使染色质形成高度压缩的染色体。包装并非单纯压缩，还须保持复制、转录和修复所需的可逆开放。

核仁通常分为纤维中心、致密纤维组分和颗粒组分，并含核仁相关染色质。纤维中心富含 rDNA 和转录相关因子；rDNA 转录多发生在纤维中心与致密纤维组分交界，早期 pre-rRNA 加工和修饰主要在致密纤维组分；后期加工以及核糖体亚基预组装主要在颗粒组分。核仁无膜包围，是由 rDNA 转录、rRNA 和蛋白质多价相互作用形成的动态凝聚体，其大小与核糖体发生水平相关。

核仁是核糖体发生中心。RNA 聚合酶 I 转录 rDNA 产生 47S/45S pre-rRNA，snoRNP 参与切割、2′-O-甲基化和假尿苷化，形成 18S、5.8S 和 28S rRNA；5S rRNA 由 RNA 聚合酶 III 在核仁外转录后进入核仁。核糖体蛋白在胞质合成并通过核孔入核，与 rRNA 组装成 40S 和 60S 前体亚基，质量控制后分别输出到胞质，在翻译时组装成完整核糖体。因此核仁依次完成 rRNA 转录、加工修饰和亚基预组装。

蛋白质合成旺盛的细胞需要大量核糖体，因而 rDNA 转录、pre-rRNA 加工、核糖体蛋白导入和亚基组装均增强。活跃的核仁组织区增多，纤维与颗粒组分积累，使核仁体积增大、染色更明显。代谢旺盛细胞通常也需高水平酶和结构蛋白更新，所以同样表现出明显核仁。核仁大小本质上反映核糖体发生和蛋白质合成需求，而不是核仁本身直接合成蛋白质；核糖体亚基须输出到胞质后才参与翻译。

间期核仁具有纤维中心、致密纤维组分和颗粒组分，持续进行 rDNA 转录、rRNA 加工和核糖体亚基组装。进入有丝分裂前期后，Cyclin B-CDK1 等使 RNA 聚合酶 I 转录受抑，核仁结构解体，核仁蛋白和加工因子分散或形成染色体周围层。末期 CDK1 活性下降，rDNA 在核仁组织区重新转录，核仁蛋白先形成前核仁小体并逐渐汇聚到 NOR 周围，重建成熟核仁。因而核仁是依赖转录活动自组织的动态结构。

发育中常见两类巨型染色体。多线染色体由 DNA 多轮复制而姐妹染色单体不分离形成，多条染色线平行排列，具有带、间带和膨泡；膨泡代表局部染色质去凝缩和活跃转录，便于研究基因表达。灯刷染色体见于某些动物卵母细胞减数分裂前期，同源染色体形成二价体，染色粒两侧伸出大量成对侧环，侧环为活跃转录单位，为卵细胞积累大量 RNA。二者都通过放大 DNA 模板和展开转录区满足特定发育阶段的大量转录需求，但形成机制和细胞背景不同。

复制依赖型组蛋白基因在几乎所有增殖细胞中必需，因为 S 期新复制 DNA 需要及时包装；从功能广泛性看具有“管家”属性。但其表达并非持续恒定，而是与 S 期严格耦联：转录增强，特有的非 poly(A) mRNA 3′端加工和稳定性提高，S 期结束后 mRNA 迅速降解。因此不能机械归为典型持续表达的管家基因，也不是只在少数分化细胞表达的奢侈基因。较准确的答案是：它属于广泛必需但细胞周期调控显著的特殊基因群。

线粒体由外膜、膜间隙、内膜和基质组成。外膜含 porin、通透性较高；内膜高度选择性并形成嵴，含呼吸链、ATP 合酶和转运蛋白；基质含三羧酸循环酶、mtDNA、RNA 和核糖体。叶绿体由双层被膜、基质和类囊体系统构成；类囊体堆叠成基粒并由基质片层相连，膜内为类囊体腔，光系统、电子传递链和 ATP 合酶位于类囊体膜；基质含 Calvin 循环酶、叶绿体 DNA 和 70S 核糖体。两者均为双膜、半自主能量转换细胞器，但内部膜系统和能量来源不同。

共同点是二者都通过膜上电子传递链定向转移电子、泵送 H⁺建立质子动力势，再由 F 型 ATP 合酶进行化学渗透耦联合成 ATP。氧化磷酸化在线粒体内膜，以 NADH/FADH₂为电子供体、O₂为终末受体，H⁺泵入膜间隙后回到基质，并伴随有机物氧化。光合磷酸化在类囊体膜，光能激发电子，非环式通路由水供电子、NADP⁺受电子并释放 O₂，H⁺积累于类囊体腔后回到基质。前者产生供全细胞使用的 ATP，后者主要为碳同化同时提供 ATP 和 NADPH。

线粒体和叶绿体具有自身环状 DNA、RNA、类似细菌的核糖体和一定的蛋白质合成能力，可通过生长和分裂增殖，因此具有相对自主性。但其基因组只编码少量 rRNA、tRNA 和能量转换复合体亚基，绝大多数结构蛋白、复制转录因子和代谢酶由核基因编码，在胞质合成后输入；细胞器的发生、分裂及功能也受细胞核调控。其生存又依赖宿主提供脂质和代谢物。所以二者既不能完全由细胞核即时新生，也不能脱离细胞独立生活，称为半自主性细胞器。

半自主性表现为拥有环状 DNA、RNA、70S 型核糖体、部分独立的复制转录翻译体系和二分裂样增殖，但多数蛋白由核基因编码并导入。内共生学说的依据包括：双层被膜与吞噬来源相符；基因组呈环状且无典型真核组蛋白；核糖体、起始氨基酸和抗生素敏感性类似细菌；线粒体与 α-变形菌、叶绿体与蓝细菌在序列和系统发育上同源；只能由已有细胞器分裂产生；大量原细菌基因已转移至宿主细胞核。长期共生和基因转移解释了今日的半自主状态。

叶绿体与蓝细菌有多方面同源性：二者都具有叶绿素和相似的光系统、类囊体膜电子传递链及 Calvin 循环；叶绿体环状 DNA、70S 核糖体、二分裂方式和对部分抗生素的敏感性接近细菌；分子系统发育把叶绿体基因置于蓝细菌谱系。叶绿体具有双层被膜，符合祖先真核细胞吞噬后未消化的结构结果；核基因中还存在大量来自蓝细菌、带叶绿体靶向肽的基因，说明共生后发生基因向细胞核转移。上述结构、生化和序列证据共同支持内共生起源。

可分离完整线粒体并制备内膜亚线粒体颗粒，再将呼吸链与 ATP 合酶功能进行生化分辨。分别测定 NADH/琥珀酸驱动的耗氧、膜电位或质子泵出，以及 ADP+Pi 的 ATP 合成；加入 rotenone、antimycin A、cyanide 等呼吸链抑制剂，寡霉素抑制 ATP 合酶，FCCP 解偶联质子梯度。预期呼吸链抑制剂同时阻断耗氧和 ATP 合成；寡霉素直接阻断 ATP 合成并继发抑制受耦联呼吸；解偶联剂使耗氧继续或升高而 ATP 合成停止。进一步纯化复合体并以免疫电镜/蛋白质组定位，可证明电子传递复合体与 ATP 合酶是内膜上不同但经质子梯度耦联的结构系统。

先在低温等渗条件下分离完整线粒体并用标志酶检验纯度。利用外膜通透性较高和对低渗更敏感的特点，使线粒体低渗肿胀、选择性破裂外膜，离心分出外膜和含完整内膜—基质的 mitoplast，膜间隙可溶蛋白进入上清。随后对 mitoplast 机械破碎或超声处理，使内膜碎裂并释放基质，再用差速和蔗糖密度梯度离心分开内膜与基质。最后用 monoamine oxidase/porin、cytochrome c、succinate dehydrogenase/ATP synthase、citrate synthase 等标志物鉴定外膜、膜间隙、内膜和基质，并检测交叉污染。

细胞表面受体主要有三类。①离子通道偶联受体：配体结合直接改变通道开闭，迅速改变膜电位或胞内离子浓度，如烟碱型乙酰胆碱受体。②G 蛋白偶联受体：七次跨膜受体激活异源三聚体 G 蛋白，调控腺苷酸环化酶、PLCβ 或离子通道，产生 cAMP、IP₃/DAG、Ca²⁺等第二信使。③酶联受体：受体自身有酶活性或结合酶，如 RTK 二聚并自磷酸化后启动 Ras—MAPK、PI3K—Akt，细胞因子受体则经 JAK—STAT。三类受体均把胞外配体识别转换成胞内效应，并有放大和终止机制。

受体是能特异识别信号配体并把结合事件转为细胞效应的蛋白，具有特异性、高亲和性、可逆性、饱和性和组织/细胞特异性，并可脱敏和下调。细胞表面受体分为离子通道偶联、G 蛋白偶联和酶联受体。以 cAMP 通路为例：配体结合 GPCR，使 Gsα 交换 GDP 为 GTP并与 βγ 分离；Gsα-GTP 激活腺苷酸环化酶，ATP 转为 cAMP；cAMP 结合 PKA 调节亚基，释放催化亚基，磷酸化代谢酶和 CREB 等。Gα 水解 GTP、PDE 降解 cAMP、磷酸酶去磷酸化完成终止。

胞外信号按作用距离可分为内分泌、旁分泌、自分泌、突触和接触依赖信号；按化学性质可分为亲水性肽类/儿茶酚胺、疏水性甾体/甲状腺激素以及 NO 等气体。亲水信号不能自由穿越脂双层，多结合离子通道偶联、GPCR 或酶联膜受体；甾体和甲状腺激素可进入细胞，结合胞质或核内受体并调节转录；NO 可扩散并激活可溶性鸟苷酸环化酶。受体选择不仅取决于配体是否过膜，也决定反应速度、放大方式、持续时间和细胞特异效应。

胞外信号传递可概括为六步：①受体特异识别配体；②受体构象改变、二聚或通道开闭，把信号跨膜转换；③GTPase、蛋白磷酸化和第二信使组成级联并放大；④不同通路在支架、细胞器和共同靶蛋白处整合；⑤调节代谢、离子通道、细胞骨架或基因表达形成效应；⑥通过配体清除、受体脱敏/内吞、GTP 水解、第二信使降解和蛋白去磷酸化终止。相同信号在不同细胞可因受体、效应蛋白和染色质状态不同产生不同结果。

级联放大的优越性在于一个配体—受体复合物可激活多个 G 蛋白或酶，每个酶又产生大量第二信使并激活多个下游分子，使低浓度信号产生显著反应，提高灵敏度。多级结构还提供分支、汇合、反馈和空间定位节点，可快速协调多个效应并进行精细调节。代价是噪声和过度激活也可能被放大，因此细胞必须配套受体脱敏、GTP 水解、PDE、磷酸酶、负反馈和蛋白降解，使信号具有阈值、时限和可逆性。

第一类是蛋白磷酸化开关：蛋白激酶把 ATP 的磷酸基转移到 Ser/Thr/Tyr，使底物活化或失活；蛋白磷酸酶去除磷酸，恢复另一状态。第二类是 GTPase 开关：GDP 结合态通常关闭，GEF 促进 GDP 释放和 GTP 结合而开启，GAP 促进 GTP 水解而关闭，某些小 GTPase 还受 GDI 控制膜—胞质循环。异源三聚体 G 蛋白由 GPCR 充当核苷酸交换因子。两类开关均可逆、可级联并受时空限制，但一个改变共价磷酸化状态，另一个改变所结合核苷酸。

信号分子按作用方式分为内分泌、旁分泌、自分泌、突触和接触依赖信号，按性质分为亲水性分子、疏水性激素和气体分子。它们通常在低浓度下作用，配体—受体结合具有高亲和力和特异性；同一信号因受体及胞内网络不同可产生不同效应，多种信号又可整合。信号反应具有可放大、可反馈、可适应和可终止的特点，并常以脉冲、持续时间或振荡频率编码信息。长期不能终止的生长信号可导致癌变，说明瞬时性与可逆性同样重要。

共同点：两者常由七次跨膜 GPCR 激活异源三聚体 G 蛋白，均产生第二信使、具有级联放大和多种终止机制。cAMP 通路中 Gsα-GTP 激活腺苷酸环化酶，ATP 生成 cAMP，cAMP 激活 PKA，磷酸化代谢酶和 CREB；Gi 可抑制 AC。IP₃/DAG 通路中 Gqα-GTP 激活 PLCβ，裂解膜 PIP₂为可溶性 IP₃和膜内 DAG；IP₃打开 ER Ca²⁺通道，Ca²⁺与 DAG 激活经典 PKC，Ca²⁺还经 calmodulin 调节多种酶。终止分别依赖 PDE、GTP 水解、IP₃代谢、Ca²⁺回收和 DAG 代谢。

磷脂酰肌醇通路即 PLC 裂解 PIP₂产生 IP₃和 DAG 的通路。它与 cAMP 通路都可由 GPCR—G 蛋白启动并通过第二信使放大。差异在于：cAMP 通路由 Gs—AC 以 ATP 生成可溶性 cAMP，主要靶为 PKA；磷脂酰肌醇通路由 Gq—PLCβ 水解膜磷脂，IP₃扩散至 ER 释放 Ca²⁺，DAG 留在膜内并与 Ca²⁺共同激活 PKC。前者由 PDE 降解 cAMP，后者依靠 IP₃/DAG 代谢和 Ca²⁺泵回收终止。

cAMP 与 Ca²⁺通路可在产生、效应和终止多个层面交互。Ca²⁺/calmodulin 可激活或抑制不同 AC 亚型，并激活 CaM-PDE 加速 cAMP 降解；PKA 可磷酸化质膜 Ca²⁺通道、IP₃受体、SERCA 调节蛋白或 Ca²⁺泵，改变 Ca²⁺进入、释放和清除。下游 PKA 与 CaMK 可共同调节 CREB，PKC 也能影响 PDE 或 AC。因而一个信号的强度、持续时间和振荡可重塑另一通路，细胞通过交叉调控实现协同、拮抗和细胞类型特异的输出。

NO 由一氧化氮合酶 NOS 以 L-精氨酸、O₂和 NADPH 为底物生成，同时产生瓜氨酸；eNOS/nNOS 常受 Ca²⁺-calmodulin 调节，iNOS 在炎症中诱导并可持续产生较多 NO。NO 为短寿命脂溶性气体，可从内皮扩散到平滑肌并结合可溶性鸟苷酸环化酶的血红素，促 GTP 生成 cGMP。cGMP 激活 PKG，调节离子通道、磷酸酶和 PDE，使胞质 Ca²⁺下降、肌球蛋白轻链去磷酸化，导致血管舒张。PDE5 降解 cGMP；过量 NO/活性氮可造成氧化损伤。

许多细胞因子受体没有内在激酶结构域，其胞质尾部结合 JAK。配体结合使受体二聚或重排，邻近 JAK 相互磷酸化并活化，这是 JAK“承接”胞外信号；JAK 随后磷酸化受体 Tyr，形成 SH2 对接位点，募集 STAT 并将其磷酸化。磷酸化 STAT 二聚、入核并调节靶基因，这是 JAK“开启”转录输出。JAK 因而连接受体构象变化与 STAT 核反应。SOCS 可抑制 JAK或促受体降解，PIAS、蛋白磷酸酶等终止信号。

Ras 是小 GTPase，GDP 结合时关闭，受体酪氨酸激酶经 Grb2—SOS（GEF）促其结合 GTP而开启；Ras-GTP 激活 Raf—MEK—ERK 等通路，促进增殖和分化。正常 Ras 依靠内在 GTPase 活性并由 GAP 加速水解 GTP，迅速关闭。常见点突变位于 Gly12、Gly13 或 Gln61，妨碍催化或 GAP 作用，使 GTP 水解显著下降，Ras 长期锁定在 GTP 活化态，即使无生长因子也持续传递 MAPK、PI3K 等信号，推动增殖、存活和代谢重编程，故成为获得功能型癌基因。

各类 G 蛋白共同以 GDP/GTP 循环作为分子开关。异源三聚体 G 蛋白由 GPCR 促进 Gα 交换 GDP/GTP，Gα-GTP 与 Gβγ 调控 AC、PLC 或通道，RGS 促水解关闭。Ras 由 GEF/GAP 控制，调节增殖和分化；Rho（Rho/Rac/Cdc42）还受 GDI 调节，控制肌动蛋白、极性和迁移；Rab 由特异 GEF/GAP/GDI 控制膜泡身份、系链和运输；Ran 依靠核内 RCC1 和胞质 RanGAP 建立梯度，控制核质运输与纺锤体；Arf/Sar 调节 COPI、clathrin 或 COPII 包被募集。若题目要求“四类”，可按教材选其中四类，但每类均须写开关控制和主要功能。

细胞周期包括 G1、S、G2 和 M 期，部分细胞可由 G1 进入静止的 G0。G1 期细胞生长、合成 RNA/蛋白并决定是否通过限制点；S 期完成 DNA 复制和中心体复制，DNA 含量由 2C 增至 4C；G2 期继续生长并检查复制是否完整；M 期包括有丝分裂和胞质分裂，将复制的染色体和细胞质分配给两个子细胞。周期由 Cyclin-CDK 顺序激活、磷酸化、SCF/APC-C 介导的蛋白降解和 G1/S、G2/M、纺锤体检查点共同保证单向、准确运行。

真核周期分 G1、S、G2、M 和可选的 G0，各期分别完成生长与限制点决策、DNA 复制、复制完成检查、染色体分离和胞质分裂。核心引擎是不同 cyclin 周期性积累并激活 CDK；CDK 活性还由 CAK、Wee1/Myt1、Cdc25 和 CKI 调节。SCF 识别已磷酸化底物推动 G1/S，APC/C 降解 securin 和 cyclin B 触发后期及退出 M。DNA 损伤/复制检查点经 ATM/ATR—Chk—p53/p21 抑制 CDK，纺锤体检查点在动粒未正确附着时抑制 APC/C。正反馈造成快速转换，蛋白降解使关键步骤不可逆。

复制起始点在低 CDK 活性的晚 M/G1 获得许可：ORC 结合起始点，招募 Cdc6 和 Cdt1，把 MCM2-7 解旋酶装载为前复制复合体。进入 S 期后，S-CDK 和 DDK 激活已许可起始点，形成复制叉。同时高 CDK 磷酸化 ORC/Cdc6 等并促 Cdc6 输出或降解，geminin 抑制 Cdt1，已启动的 MCM 随复制叉离开起始点，从而禁止重新装载。只有 M 期末 CDK 下降、APC/C 降解 geminin 后才可再次许可。由“许可只在低 CDK、启动只在高 CDK”保证每个起始点一周期仅复制一次。

MPF 即成熟促进因子/有丝分裂促进因子，核心为 Cyclin B-CDK1。Cyclin B 在 G2 积累并结合 CDK1，CAK 加激活性磷酸，Wee1/Myt1 加抑制性磷酸使复合物暂时无活性；Cdc25 去除抑制磷酸后，少量 MPF 通过激活 Cdc25、抑制 Wee1 形成正反馈，促细胞快速进入 M 期。MPF 磷酸化凝缩蛋白、核纤层、微管和 Golgi 相关蛋白，引起染色体凝缩、核膜破裂和纺锤体形成。随后 APC/C-Cdc20 降解 securin 与 Cyclin B，启动后期并使 CDK1 失活，完成 M 期退出。

MPF 是 Cyclin B 与 CDK1 组成的 Ser/Thr 蛋白激酶。活化条件包括：Cyclin B 积累并与 CDK1 结合；CAK 在 CDK1 激活环位点磷酸化；Cdc25 去除 Wee1/Myt1 加到 CDK1 Tyr15/Thr14 的抑制性磷酸。活化的 MPF 又激活 Cdc25、抑制 Wee1，形成正反馈和阈值式启动；Cyclin B 的核转位也促进底物接触。若 DNA 未复制完或受损，Chk1/Chk2 抑制 Cdc25，阻止活化。M 期后 APC/C 促 Cyclin B 降解，MPF 活性下降。

G2/M 转换时，Cyclin B-CDK1 经 Cdc25 正反馈迅速活化。MPF 磷酸化凝缩蛋白和组蛋白相关底物，使染色质凝缩；磷酸化 lamins、核孔和内核膜蛋白，使核被膜解体；调节微管相关蛋白和马达，增强微管动态并建立纺锤体；磷酸化 Golgi/ER 相关蛋白，使内膜系统发生分裂期重构；还促进中心体成熟和分离。这些并行底物使细胞整体进入 M 期状态。DNA 损伤或未完成复制通过 ATM/ATR—Chk 抑制 Cdc25，从入口处阻断 MPF 的爆发式活化。

制备同步的 M 期细胞和间期细胞，分别获得胞质提取液；把等量提取液显微注射入处于 G2 期、尚未成熟的蛙卵母细胞或间期细胞。M 期提取液应诱导核膜破裂、染色体凝缩、纺锤体相关磷酸化和成熟表型，而间期提取液、热灭活 M 期提取液及缓冲液不应诱导。进一步免疫去除 CDK1 或 Cyclin B 后活性消失，补加纯化 Cyclin B-CDK1 后恢复；可同时检测组蛋白 H1 激酶活性。M 期状态可被提取液转移且依赖 Cyclin B-CDK1，即证明其中含 MPF。

Rb 是 G1/S 限制点的核心抑制蛋白。早 G1 时低磷酸化 Rb 结合 E2F，并招募染色质抑制复合物，阻止 DNA 复制所需 Cyclin E、DNA 聚合酶等基因转录。生长因子诱导 Cyclin D-CDK4/6，随后 Cyclin E-CDK2 逐步磷酸化 Rb，使其释放 E2F；E2F 激活 S 期基因及自身正反馈，细胞越过限制点。DNA 损伤时 p53 诱导 p21 抑制 CDK，使 Rb 保持低磷酸化并继续抑制 E2F。Rb 缺失或持续高磷酸化会使 E2F 失控并促进异常增殖。

Rb 主要控制 G1/S 限制点：低磷酸化 Rb 结合并抑制 E2F，阻止 S 期基因表达；Cyclin-CDK 磷酸化 Rb 后 E2F 释放。Rb 功能丧失使细胞绕过外源生长约束。p53 是应激响应转录因子，DNA 损伤时由 ATM/ATR 等稳定并活化，诱导 p21 抑制 CDK，使 Rb 保持抑制态并暂停周期；同时促进 DNA 修复。损伤不可修复时，p53 诱导 PUMA、NOXA、BAX 等导致线粒体凋亡，或建立细胞衰老。二者分别守住限制点和损伤决策，共同防止突变细胞扩增。

SCF 与 APC/C 都是 E3 泛素连接酶，通过时序性蛋白降解赋予周期不可逆性。SCF 的 F-box 蛋白识别已被磷酸化的特定底物，复合体总体较恒定；它可降解 CKI 等，促进 G1/S 和 S 期。APC/C 的底物识别依赖 Cdc20 或 Cdh1：中期所有动粒正确附着后，APC/C-Cdc20 降解 securin，释放 separase 切开 cohesin，并降解 Cyclin B 启动 M 期退出；APC/C-Cdh1 在末期和 G1 维持低 M-CDK，帮助重建复制许可。SCF 常由底物磷酸化决定时间，APC/C 更依赖周期性共激活因子。

正常周期由外源生长信号、Cyclin-CDK 引擎、CKI、蛋白磷酸化/去磷酸化、SCF/APC-C 降解和检查点共同控制。限制点判断营养与生长因子，DNA 损伤和复制检查点通过 ATM/ATR—Chk—p53/p21 抑制 CDK，纺锤体检查点在动粒未正确附着时抑制 APC/C。癌基因可由点突变、扩增或易位使受体、Ras、Myc、Cyclin 等持续活化；抑癌基因 Rb、p53、APC 等丧失则解除制动。二者共同使细胞无需外源信号、绕过损伤和凋亡、不断复制并积累基因组异常，形成恶性增殖。

先提出“蛋白 A 的丰度、定位或活性随周期变化并决定某一转换”的假设。用双胸苷、血清饥饿或有丝分裂阻断同步细胞，释放后按时间取样，以 Western、免疫荧光和流式 DNA 含量确定 A 的周期性。再用 siRNA/CRISPR/诱导降解降低 A，过表达 A，并检测 EdU、DNA 含量、pH3、Cyclin 标志和活细胞成像，判断阻滞阶段；设置非靶向、空载体和多个独立序列。最后用不受 siRNA 影响的野生型回补表型，并用功能位点突变体不能回补来定位机制。表达相关、功能丧失、获得功能和特异回补形成完整因果证据链。

有丝分裂可分为前期、前中期、中期、后期和末期，随后完成胞质分裂。前期染色质凝缩、核仁消失、中心体分离并形成纺锤体；前中期核膜破裂，微管捕获动粒并校正连接；中期染色体双极附着并排列于赤道板，纺锤体检查点监测附着和张力；后期 cohesin 被切开，姐妹染色单体分别向两极运动，同时两极拉开；末期染色体去凝缩、核膜和核仁重建、纺锤体解体。动物细胞随后由肌动蛋白—肌球蛋白收缩环缢裂，植物细胞形成细胞板。

微管构成纺锤体，负责动粒捕获、染色体排列和分离；星体微管定位分裂轴，极间微管推动两极分开。肌动蛋白与 myosin II 在赤道形成收缩环完成胞质分裂，中间纤维核纤层在前期解聚、末期重建。秋水仙素结合微管蛋白并阻止纺锤体形成，使复制后的姐妹染色单体不能正常向两极分离，细胞停滞于中期样状态。若药物解除后细胞未死亡而跳过正常分裂、重新进入间期或再次复制，全部染色体可保留在同一核内，形成染色体数加倍的多倍体；植物育种常利用这一原理。

两者均在一次 S 期后利用纺锤体分配染色体，但有丝分裂只分裂一次，产生两个与母细胞倍性相同、遗传组成通常相近的子细胞；同源染色体不联会，后期分离姐妹染色单体。减数分裂连续分裂两次而 DNA 只复制一次：前期 I 同源染色体联会并发生非姐妹染色单体交换，中期 I 同源对独立排列，后期 I 同源染色体分离而着丝粒不裂；减数 II 才分离姐妹染色单体。最终形成四个单倍体、遗传组成不同的细胞，用于配子形成并维持世代染色体数稳定。

有丝分裂一次复制接一次分裂，不发生同源联会和常规交换，后期分离姐妹染色单体，产生两个倍性不变的子细胞；减数分裂一次复制后连续两次分裂，前期 I 同源联会和交换，后期 I 分离同源染色体，最终产生四个单倍体细胞。减数分裂通过减半染色体数维持有性生殖世代稳定，并以交换和独立分配增加遗传多样性。近亲个体更可能携带来自共同祖先的相同有害隐性等位基因，婚配后子代形成隐性纯合子的概率提高，因此遗传病风险增加；危害来自共同等位基因纯合概率升高，而不是重组本身有害。

减数分裂产生多样性的主要来源有三项：前期 I 同源染色体联会，非姐妹染色单体在同源位点交换，形成新的等位基因组合；中期 I 每对父源和母源同源染色体在赤道板上的朝向彼此独立，后期 I 随机分配，理论组合数可达 2ⁿ；减数 II 后形成遗传组成不同的配子。受精时精卵又随机结合，进一步组合父母双方基因组。加上突变等因素，同一父母的多个子代几乎不可能具有完全相同的遗传组合，故“一母生九子，九子各不同”。

细胞凋亡是受基因调控、能量依赖的程序性细胞清除过程。形态上细胞皱缩、胞质致密、染色质边集和凝缩、细胞核碎裂、质膜起泡并形成凋亡小体，膜在较长时间内保持完整；生化上 caspase 级联活化，核纤层和骨架等底物被切割，磷脂酰丝氨酸外翻，CAD 造成核小体间 DNA 断裂。凋亡小体被邻近细胞或巨噬细胞识别吞噬，内容物不大量外泄，通常不引发明显炎症。凋亡参与发育塑形、组织稳态、免疫选择和清除受损细胞。

Caspase 是以活性位点半胱氨酸切割底物天冬氨酸后肽键的蛋白酶，通常以无活性 procaspase 存在。启动者 caspase-8/9/10 含长前结构域，在 DISC 或凋亡小体中通过近距离聚集活化；执行者 caspase-3/6/7 被启动者切割后形成活性酶，进一步切割核纤层、细胞骨架、PARP 和 ICAD。ICAD 切割释放 CAD，导致核小体间 DNA 断裂。该蛋白水解级联具有放大性和不可逆性；IAP 抑制 caspase，线粒体释放 Smac 可解除其抑制，从而决定凋亡是否完成。

Bcl-2 家族按功能分三组：Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1 等抗凋亡蛋白结合并抑制促凋亡成员；Bax、Bak 是效应蛋白，寡聚后使线粒体外膜通透化；Bim、Bid、PUMA、NOXA、Bad 等 BH3-only 蛋白感受 DNA 损伤、生存因子缺乏或 ER 应激，抑制抗凋亡蛋白并直接或间接激活 Bax/Bak。三组蛋白的相互作用决定 MOMP 阈值。MOMP 释放 cytochrome c 和 Smac，促凋亡小体与 caspase 级联，通常标志细胞越过内源性凋亡的关键不可逆点。

正常情况下细胞色素 c 位于线粒体膜间隙侧，与内膜外表面松散结合，是呼吸链可移动电子载体，把复合体 III 的电子传递给复合体 IV，参与氧化磷酸化。凋亡刺激使 BH3-only 蛋白改变 Bcl-2 家族平衡，Bax/Bak 寡聚引起线粒体外膜通透化，细胞色素 c 进入胞质。它与 Apaf-1、dATP/ATP 结合形成七聚凋亡小体，募集并活化 procaspase-9，继而激活 caspase-3/7。由此同一蛋白在线粒体内维持能量代谢，释放后则成为内源性凋亡信号。

线粒体是内源性凋亡的整合枢纽。DNA 损伤、缺乏生存信号、氧化或 ER 应激激活 BH3-only 蛋白，后者抑制 Bcl-2/Bcl-xL/Mcl-1 并激活 Bax/Bak，造成线粒体外膜通透化。随后 cytochrome c 与 Apaf-1、dATP 组装凋亡小体并激活 caspase-9；Smac/DIABLO 拮抗 IAP，促进执行者 caspase 活化，其他线粒体因子也可参与核损伤。线粒体膜电位和代谢同时改变。外源性通路还可由 caspase-8 切割 Bid 为 tBid，把死亡受体信号放大到线粒体。

凋亡时 caspase-3 切割 ICAD，释放 CAD 核酸酶。CAD 优先切割核小体之间较暴露的连接 DNA，每个核小体重复单位约 180–200 bp，因此形成该长度及其整数倍的片段，琼脂糖凝胶电泳呈规则梯状条带。病理性坏死时能量耗竭、离子失衡和膜早期破裂，各类核酸酶无序进入或活化，DNA 在随机位置降解，片段长度连续分布，电泳呈弥散 smear。该差异反映有序程序性切割与无序随机降解，但实际判定细胞死亡仍应结合膜完整性、caspase 等多项指标。

凋亡是受控的细胞清除程序，表现为细胞皱缩、染色质凝缩、caspase 活化、凋亡小体形成和无明显炎症清除。自噬是溶酶体依赖的胞质成分降解回收过程：ULK1 启动，Beclin1-VPS34 产生 PI3P，隔离膜扩展并由 LC3 脂化形成双膜自噬体，随后与溶酶体融合。基础或适度自噬清除损伤细胞器、应对饥饿，通常促存活；持续过强或通量失衡可参与死亡。两者均受信号调控，但形态、核心分子和直接目的不同，不能把“出现自噬体”等同于细胞已死亡。

凋亡以 caspase 级联、细胞皱缩、DNA 有序断裂和凋亡小体清除为特征；宏自噬以双膜自噬体形成及溶酶体降解为核心，通常回收物质并促进应激存活。二者可互相调节：Bcl-2/Bcl-xL 可结合 Beclin1 抑制自噬，BH3-only 蛋白释放 Beclin1；caspase 可切割 Beclin1 等自噬蛋白使细胞转向凋亡；自噬清除损伤线粒体可降低 ROS 和凋亡信号，也可能降解抗凋亡因子。应激强度、时间和细胞类型决定结局。实验需测自噬流而非只看 LC3-II，并联合 Annexin V、caspase 等判定死亡方式。

程序性细胞死亡是由遗传和信号网络调控、按一定步骤执行的细胞死亡。经典凋亡具有能量依赖、caspase 级联、细胞皱缩、染色质凝缩、膜起泡、凋亡小体和低炎症清除等特征；现代概念还包括程序性坏死、焦亡和铁死亡等受调控方式，机制各异。其生物学意义包括胚胎发育塑形、神经和免疫细胞筛选、维持组织细胞数量、清除 DNA 损伤或感染细胞、防止肿瘤及终止炎症。过少可促癌和自身免疫，过多则参与神经退行、缺血损伤等疾病。

细胞全能性指一个细胞在适宜条件下形成完整个体及相关组织的潜能；细胞核全能性强调分化细胞核通常仍保留构建完整个体所需的遗传信息。植物实验可将单个体细胞无菌培养，在生长素/细胞分裂素调节下脱分化形成愈伤组织，再分化为根、芽和完整植株。动物可把体细胞核移入去核卵母细胞，激活后形成胚胎并获得克隆个体，以遗传标记证明核基因组来自供体。意义在于证明分化主要是选择性基因表达而非基因丢失，并奠定克隆、重编程和再生医学基础。

发育潜能通常从受精卵全能性，经多能、专能逐步受限，原因主要是转录因子网络、DNA 甲基化、组蛋白修饰、染色质结构和细胞质环境建立稳定的差异表达，而非大规模丢失基因。实验上取已分化供体细胞，取成熟卵母细胞并去核，将供体核显微注射或电融合进入卵母细胞，激活后体外培养至早期胚胎并移入代孕母体。设置未去核、假操作和不同供体对照，用核 DNA 多态标记证明后代来自供体核。能发育为正常个体即说明卵细胞质可重编程分化核并揭示其保留的发育潜能。

植物体细胞克隆利用细胞全能性：无菌取外植体，经适宜生长素/细胞分裂素诱导脱分化形成愈伤组织，再生根芽并形成完整植株。动物体细胞克隆采用体细胞核移植：去除卵母细胞核，导入供体体细胞核，激活、培养胚胎并移入代孕动物，依靠卵细胞质重编程。两者可快速繁殖优良基因型、保存种质、制备转基因材料和疾病模型；动物核移植还用于治疗性克隆研究。局限包括植物体细胞变异，动物效率低、表观重编程不完全、发育异常、遗传多样性下降及伦理和福利问题。

胚胎干细胞通常从囊胚内细胞团分离，在饲养层或定义培养体系中加入维持多能性的因子，使其长期自我更新而不分化；通过 OCT4、SOX2、NANOG 等标志、三胚层分化及核型检验确认。iPS 细胞则从成纤维细胞等体细胞出发，导入经典 OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC 或替代组合，筛选形态和标志类似 ES 的克隆并扩增。iPS 还需验证表观遗传重置、三胚层分化、遗传稳定性和肿瘤风险。ES 来源于胚胎，多能状态被保持；iPS 是分化细胞经因子重编程重新获得多能性。

干细胞是能长期自我更新，并在适当条件下产生一种或多种分化细胞的细胞，可分为胚胎干细胞、诱导多能干细胞和成体干/祖细胞。重要成就包括 ES 长期培养和定向分化、iPS 重编程、造血干细胞移植、患者特异疾病模型、基因编辑后细胞治疗以及类器官重建组织结构。未来可用于药物筛选、个体化疾病模型、修复视网膜、神经、心肌等组织和构建移植组织。主要障碍是分化纯度和成熟度、肿瘤形成、免疫排斥、遗传/表观遗传异常、规模化质量控制及胚胎来源和生殖应用的伦理问题。

细胞分化是同源细胞产生稳定形态、结构和功能差异的过程，本质是差异性基因表达。胞外形态发生素、细胞接触和 ECM 经信号通路激活特定转录因子组合，形成互相激活或抑制的基因调控网络；DNA 甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和三维基因组结构稳定表达状态；非编码 RNA、可变剪接、mRNA 稳定与翻译、蛋白修饰和降解进一步调节。细胞间诱导、侧向抑制和干细胞龛提供空间信息。分化通常稳定但仍有可塑性，核移植、iPS 和转分化说明改变调控网络可重编程命运。

组蛋白修饰既能改变核小体的物理性质，又能建立招募调控蛋白的平台。赖氨酸乙酰化中和正电荷、减弱组蛋白—DNA/核小体相互作用，并被 bromodomain 蛋白识别，通常提高染色质可及性；去乙酰化常与抑制相关。甲基化不改变电荷，效应取决于位点和程度，如 H3K4me3 常标记活跃启动子，H3K27me3 和 H3K9me3 常与抑制相关，并分别招募 Polycomb 或异染色质蛋白。干细胞发育基因可具有双价标记，分化时解析为活化或沉默。修饰与 writer、eraser、reader 及重塑复合物共同稳定细胞类型特异表达。

器官再生首先由损伤细胞释放信号并启动止血、炎症和免疫清除，随后生长因子、Wnt、Hippo 等激活组织干/祖细胞，或使部分成熟细胞去分化、重新进入周期。细胞增殖、极化和迁移与 ECM 降解、重新沉积及血管生成协调，之后按位置线索再分化、重建组织结构，多余细胞经凋亡清除，最终恢复稳态。肝部分切除后主要由剩余肝细胞代偿性增殖恢复质量；骨骼肌损伤则激活卫星细胞增殖、融合成肌纤维。若炎症持续或模式控制失败，再生可转为纤维化或异常增生。

癌细胞是遗传和表观遗传改变累积后，获得持续增殖、生存、侵袭等异常表型的细胞。癌症是细胞周期疾病，因为生长受体、Ras、Myc、Cyclin 等持续活化，或 Rb、p53 等抑癌机制失效，使细胞绕过限制点和损伤检查点。它也是分化疾病，因为命运决定转录因子和表观遗传网络异常，细胞停留在未成熟、可增殖状态或发生去分化。完整癌变还包含逃避凋亡、复制永生化、基因组不稳定、代谢重编程、血管生成、免疫逃逸和微环境改造，故不是单一周期蛋白异常所能解释。

正常贴壁细胞具有接触抑制和锚定依赖：形成单层并与邻细胞接触后停止增殖，脱离合适 ECM 时发生 anoikis；癌细胞常丧失这两种特点，可堆叠生长并在软琼脂中形成克隆。恶性增殖来自受体/Ras/PI3K、Myc、Cyclin 等持续信号以及 Rb/p53、凋亡通路失活。扩散和迁移则与 EMT、E-cadherin 下降、整联蛋白谱改变、Rho 骨架重塑、MMP 降解基底膜和趋化有关；进入血管后还需抗失巢凋亡、逃避免疫并在远端重新黏附和增殖。

正常细胞的增殖和分化由配体浓度、受体数量、信号持续时间、负反馈及组织环境共同决定。例如短暂或持续 MAPK、PI3K-Akt、JAK-STAT、Wnt 和 TGF-β 信号可分别支持生长、生存或特定命运，检查点和凋亡限制异常反应。癌细胞可通过受体扩增/突变、Ras 或 PI3K 获得功能、磷酸酶和抑癌基因失活、分泌自分泌因子等，使通路在无配体时持续开启；同时表观遗传改变阻断终末分化。结果是自主增殖、抗凋亡和去分化。故治疗既可靶向驱动通路，也须考虑旁路激活和耐药反馈。

细胞衰老是应激诱导的稳定增殖停滞。复制性衰老常由端粒缩短触发 DNA 损伤反应，应激性衰老还可由癌基因、ROS、线粒体功能障碍、蛋白稳态下降和表观遗传损伤引起；p53-p21 和 p16-Rb 通路维持停滞。结构和表型上，细胞增大扁平，溶酶体增多并呈 SA-β-gal 阳性，线粒体和核形态异常，可形成衰老相关异染色质；分泌炎症因子、蛋白酶和生长因子构成 SASP。短期衰老可抑癌和促修复，长期积累则引起慢性炎症和组织功能下降。

脉冲—追踪利用可检测的放射性前体只标记某一短时间内新合成的大分子。先短时加入 ³H-胸腺嘧啶、³H-尿嘧啶或放射性氨基酸进行“脉冲”，随后换成大量非放射性同类前体进行“追踪”，在多个时间点固定细胞并用放射自显影或分级计数检测信号。由于脉冲后不再显著产生新标记，可根据标记随时间从一个区室转移到另一区室重建合成、运输和降解动态。例如分泌蛋白标记可依次出现在 RER、Golgi、分泌泡和胞外。

细胞培养需无菌、适宜营养和渗透压、合适温度与 CO₂/pH，并根据细胞类型提供血清、生长因子和黏附基质。小鼠脾细胞原代培养可无菌取脾，在冷培养液中机械研磨，通过滤网制成单细胞悬液，裂解红细胞、洗涤并计数，按适宜密度接种完全培养基，必要时加入淋巴细胞刺激因子。活率用台盼蓝排斥法：与染液混合后在计数板统计，膜完整的活细胞不染，死细胞蓝染；活率=未染细胞数/总细胞数×100%。应设置平行计数并注意台盼蓝只能反映膜完整性。

培养处于增殖状态的小鼠细胞，加入秋水仙素/秋水仙胺阻断纺锤体，使中期染色体富集；收集细胞后低渗处理使细胞膨胀、染色体分散，用甲醇—冰醋酸固定，滴片、干燥并 Giemsa 或带型染色。低渗和滴片的目的都是使染色体彼此分开。核型分析选择完整中期分裂相，按染色体长度、着丝粒位置和带型配对排序，判断数目及结构异常。核仁组织区可用 Ag-NOR 银染显示活跃 NOR 相关蛋白，或以 rDNA FISH 直接定位相应染色体；两者检测对象不同，最好联合验证。

先用目标抗原免疫小鼠并加强免疫，取脾脏抗原特异 B 细胞，与不能走 HGPRT 补救途径但可无限增殖的骨髓瘤细胞用 PEG 融合。HAT 培养基中，未融合骨髓瘤因补救途径缺陷死亡，未融合 B 细胞寿命有限，只有兼具 B 细胞 HGPRT 与骨髓瘤永生性的杂交瘤长期存活。再用 ELISA 等筛选分泌目标抗体的孔，通过有限稀释反复亚克隆保证单克隆，扩增后纯化抗体并鉴定特异性、亲和力和同型。HAT 是融合后生存筛选，抗原检测才是特异性筛选。

可举人—鼠细胞融合证明膜蛋白具有流动性。分别用物种特异荧光抗体标记人和鼠细胞表面抗原，用灭活病毒或 PEG 诱导细胞融合；刚融合时两种颜色分别位于异核细胞两半，37 ℃培养后逐渐在整个质膜混合，而低温或固定处理会减慢/阻止混合。由于新蛋白合成不能解释短时间内原有抗原的重新分布，该结果说明膜蛋白可在脂质双层中横向扩散。其他基于融合的成就还包括杂交瘤制备单克隆抗体和异核体研究核重编程。

经典细胞融合实验中，人和鼠细胞表面抗原分别用不同荧光抗体标记，再用 PEG 或灭活病毒诱导融合。融合初期两种荧光各占质膜一半，37 ℃孵育后逐渐均匀混合；低温、固定或骨架限制可作为对照并降低重排速度，证明膜蛋白发生侧向扩散。FRAP 也可证明：荧光标记膜分子后局部高强度漂白，若未漂白分子扩散进入使荧光恢复，则说明膜具有流动性；恢复速度反映扩散动力学，恢复比例反映可移动组分。两种方法从群体重排和局部扩散角度互相支持。

在低温等渗条件下匀浆细胞，先差速离心除去细胞核、线粒体等大结构；ER 破碎后自行封闭形成微粒体。将微粒体置于连续或不连续蔗糖密度梯度中离心，粗面 ER 微粒体因表面附着核糖体、浮力密度较高而位于较重组分，光面 ER 微粒体密度较低。收集各区带后用电子显微镜观察核糖体，并检测 RER 标志如核糖体/ribophorin 与 SER 标志如细胞色素 P450，评估纯度。若用高盐或 puromycin 去除核糖体，RER 密度应下降，构成验证原理的对照。

培养细胞铺于盖玻片，固定以保存结构，适度通透使探针进入，封闭非特异结合。微管用抗 α/β-tubulin 一抗和荧光二抗显示；F-actin 可直接用荧光鬼笔环肽，也可用抗 actin 抗体，最后以 DAPI 标核并用共聚焦观察。设置无一抗、同型 IgG、二抗单独和已知阳性细胞对照；不同颜色二抗须避免串色。可用 nocodazole/秋水仙素破坏微管、cytochalasin 或 latrunculin 破坏微丝作为结构特异性验证。定量纤维强度、方向和空间分布而非只展示代表图。

PCR 以模板 DNA、两条特异引物、dNTP、Mg²⁺和耐热 DNA 聚合酶组成体系，通过反复变性、退火和延伸，使两引物之间的目标序列近似指数扩增；产物长度由引物位置决定。应用一：用基因特异引物扩增并测序，可进行基因分型、突变检测或克隆。应用二：RNA 先逆转录成 cDNA，再以 RT-qPCR 通过荧光循环阈值比较基因表达，并以内参和扩增效率校正。还可用于病原检测、单细胞扩增等。实验需有无模板阴性、阳性模板和必要的无逆转录对照以排除污染和基因组 DNA。

RNA 干扰利用小 RNA 引导序列特异的转录后沉默。长 dsRNA 或 shRNA 经 Dicer 形成 siRNA，siRNA 装载 Argonaute-RISC 后保留向导链，与互补 mRNA 配对并促切割降解；不完全配对也可抑制翻译。实验步骤为设计多个独立 siRNA/shRNA，转染或病毒导入细胞，设置非靶向和转染试剂对照，在 mRNA 与蛋白层验证敲低，再检测表型。用不含 siRNA 靶位点或同义突变的目的基因回补，若表型恢复可证明特异性。RNAi 用于基因功能筛选和短期抑制，但需警惕脱靶和不完全敲低。

基因过表达先获得目的 CDS，克隆入含合适启动子、标签和选择标记的表达载体并测序确认；按细胞类型采用转染、电转或病毒感染，建立瞬时或稳定表达。随后用 qPCR、Western 和定位成像验证表达量与正确定位，检测增殖、信号、形态等预设表型。必须设置空载体、未处理和必要的失活突变体对照，并控制表达量；若过表达野生型产生表型、功能缺失突变体不产生且与敲低结果方向互补，因果证据更强。应用包括研究基因功能、结构域、定位信号、制备重组蛋白和细胞模型，但过量表达可能造成非生理错位或聚集。

可用一个生化方法和一个细胞内方法建立互补证据。方法一 Co-IP：用抗 A 抗体从温和裂解物免疫沉淀 A，Western 检测 B，并做反向 IP；IgG、单标签、敲除细胞和等量输入为对照。该法说明 A、B 位于同一复合体但不必然直接结合。方法二 FRET：分别将 A、B 与合适供体/受体荧光蛋白融合，若二者距离进入约 1–10 nm，可出现受体敏化发射或供体寿命下降；不相互作用突变体和单荧光对照用于校正。再用纯化蛋白 pull-down 或结合位点突变可进一步判断直接性和必要结构域。

先在组织层面确定表达：取多种组织进行 qRT-PCR 测 mRNA、Western 测蛋白，并用免疫组化或原位杂交显示组织和细胞类型分布。再在细胞层面定位：用经敲除样本验证特异性的抗体进行免疫荧光，与核、ER、Golgi、线粒体等标志物共定位；同时进行亚细胞分级和 Western 作为生化证据。可构建 GFP 融合蛋白做活细胞动态观察，但要比较 N/C 端标签并避免过表达伪影，最好用 CRISPR 在内源位点加标签。共定位用定量系数并结合超分辨或免疫电镜；多种独立方法结果一致，才能可靠确定组织分布和亚细胞定位。